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生物實(shí)驗(yàn)室那些小細(xì)節(jié)~

更新時(shí)間:2017-11-12      點(diǎn)擊次數(shù):1421

平時(shí)在實(shí)驗(yàn)室常聽到的一句話就是“今天某某試驗(yàn)沒做好是為什么?今天某某試驗(yàn)沒出結(jié)果是什么原因?今天某某試驗(yàn)為什么會(huì)是這樣的呢?” 等等。

然后仔細(xì)一查找原因,往往是由于操作上面的不認(rèn)真,或是一些小小的細(xì)節(jié)沒有注意到。以下是集各路朋網(wǎng)友的一些實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn),在此與大家分享:

1. 跑page膠的時(shí)候

小電壓跑會(huì)避免高電壓產(chǎn)生的熱量爾導(dǎo)致的膠層變形。低電壓泳道會(huì)比大電壓泳道跑的直一些,且分離效果更高,有利于分子量相差不大的蛋白分離。

 

2. 提取質(zhì)粒的時(shí)候

后一步的酒精揮發(fā)很關(guān)鍵,基本上是其后續(xù)的酶切反應(yīng)的決定性因素。所以這一步盡量揮發(fā)長一點(diǎn)時(shí)間,是空調(diào)吹熱風(fēng),或是37度溫箱放長一點(diǎn)的時(shí)間,我試過室溫過夜,酶切很好。

 

3. 做WESTERN BLOT 的時(shí)候

大家往往會(huì)摸索一抗、二抗的濃度,封閉時(shí)間,曝光時(shí)間等等,而每次變換其中的一個(gè)條件就需要從新跑膠、轉(zhuǎn)膜,甚至重新提蛋白,這樣會(huì)浪費(fèi)大量的時(shí)間。其實(shí)*沒有必要這樣。一次轉(zhuǎn)膜后,將PVDF膜晾干,裁減成小塊,保存起來,用的時(shí)候取出一塊,沒有任何影響。這對于摸索條件的戰(zhàn)友來說,節(jié)約了大量的時(shí)間。

 

4. 有關(guān)緩沖液和培養(yǎng)基配置

1)將緩沖液配方中的成分分別以10-100倍配成母液儲(chǔ)存,需要的時(shí)候只需將相應(yīng)的母液混合,補(bǔ)加水稀釋即可。

2)配培養(yǎng)基時(shí)通常會(huì)忘記各成分的量,如配LB時(shí)的三個(gè)成分不記得到底哪個(gè)是5g,哪個(gè)要10個(gè),因此可以在常用的試劑瓶的標(biāo)簽上注明所需的量,如配LB時(shí),在NaCl瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等,很方便,不需要每次配之前臨時(shí)翻書。

 

5. 有關(guān)PCR主反應(yīng)液配置

在做克隆鑒定的時(shí)候經(jīng)常需要在酶切鑒定前進(jìn)行PCR鑒定,每次配置PCR反應(yīng)液很繁瑣,可以將其配置類似kit的形式,按你需要的反應(yīng)體系列表,然后放大100倍配置100×主反應(yīng)液(100次反應(yīng)),其中含buffer,Mg2+,dNTPs,但不含引物和Taq酶,然后可以10×分裝或一管儲(chǔ)存在-20度,在需要的時(shí)候拿出融開,然后按所需的PCR反應(yīng)個(gè)數(shù)吸取相應(yīng)的倍數(shù),再補(bǔ)加相應(yīng)反應(yīng)倍數(shù)的Taq和引物,混勻后分裝,這樣做的好處如下:

1)可極大的節(jié)省寶貴的時(shí)間,可早點(diǎn)收工,看球;

2)避免每次反應(yīng)加樣不均的可能;

3)大大減少PCR假陽性的產(chǎn)生。

 

6. 有關(guān)酶切反應(yīng)液的配置

在做酶切時(shí),也可以象PCR一樣配置主反應(yīng)液,每次反應(yīng)前先列好反應(yīng)的體系,算好需要的反應(yīng)數(shù),然后按所需反應(yīng)的體系按所需反應(yīng)數(shù)放大,加入buffer、酶、水,質(zhì)粒欄空缺,然后混合后按除質(zhì)粒DNA的體積分裝,然后再在每管中加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒DNA酶切,這樣做的好處如下,特別是當(dāng)同時(shí)有10幾個(gè)陽性克隆需要鑒定時(shí)尤為明顯:

1)各反應(yīng)成分均一;

2)可大大減少限制型內(nèi)切酶的使用;

3)節(jié)省時(shí)間。

 

7. 有關(guān)SDS-PAGE:

1)可將SDS-PAGE的積層膠,分離膠預(yù)先配好大體積如100ml儲(chǔ)存在4度冰箱(注:10%AP,TEMED不加,切記!!!),每次配置時(shí)只需吸取相應(yīng)體積的預(yù)制膠加入AP,TEMED即可,沒必要每次制膠時(shí)候翻分子克隆,特別方便,而且,這樣的預(yù)制膠可儲(chǔ)存半年以上,不失為偷懶的方法;更關(guān)鍵的是可大大減少與丙稀酰胺的接觸,因此大大減少中毒的機(jī)會(huì)。2)電泳時(shí)雖然小電泳分離效果要好一些,但2小時(shí)以上的等待的時(shí)間實(shí)在是痛苦,因此可以提高電泳至150V,但需要將整個(gè)電泳槽放在放滿冰水的臉盆里散熱,這樣跑出來的膠分離效果絲毫不比低電壓來的差,關(guān)鍵是時(shí)間大大節(jié)省,不需1h即可看結(jié)果了。

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